人外周血淋巴細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)

【包裝規(guī)格】

   200ml/瓶

【貨號(hào)】

   LTS1077-1

【適用儀器】

  zui大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)

【檢驗(yàn)方法】

全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。

通用實(shí)驗(yàn)方法

1、取 2ml 新鮮抗凝血與 2ml 樣本稀釋液（產(chǎn)品編號(hào)：2010C1119）混勻。

2、取一支 15ml 離心管，加入 3ml 分離液，用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液之 

 液面上，400g，30-40min。

3、離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。

4、取白環(huán)層，加入 3 倍體積的清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）混勻，60-100g，離心 10min，棄上清。

5、加 6-8ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）混勻，60-100g，離心 10min，棄去上清，后

以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸目的細(xì)胞。

注：血液樣品量增大時(shí)，可通過(guò)改變離心管直徑的方法始終保持樣本量高度與分離液高度為

2.4cm 與 3cm，其他分離條件不變。

為滿(mǎn)足客戶(hù)實(shí)際使用需求，灝洋根據(jù)不同血液樣本量推薦具體實(shí)驗(yàn)操作方法如下：

一、 使用 15ml 離心管時(shí)：

情況 A：血液樣本量小于 3ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：

1、取一支 15ml 離心管，加入 3ml 分離液。

2、用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，400-650g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶(hù)自行摸索，以達(dá)到*分離效果）。

3、離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴

細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。

4、用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。

5、250g，離心 10min。

6、棄上清。

7、用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

8、250g，離心 10min。

9、重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

情況 B：血液樣本量為 3-6ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：

1、取一支 15ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。

2、用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，450-650g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶(hù)自行摸索，以達(dá)到*分離效果，但zui大離心力不超過(guò) 1200g）。

3、離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。

4、用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。

5、250g，離心 10min。

6、棄上清。

7、用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

8、250g，離心 10min。

9、重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

二、 使用 50ml 離心管時(shí)：

情況 A：血液樣本量為 6-10ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：

1、取一支 50ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。

2、用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500-950g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣    本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶(hù)自    行摸索，以達(dá)到*分離效果，但zui大離心力不超過(guò) 1200g）。

3、離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴

細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。

4、用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。

5、250g，離心 10min。

6、棄上清。

7、用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

8、250g，離心 10min。

9重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

情況 B：血液樣本量為 10-20ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：

1、取一支 50ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。

2、用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500-1100g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶(hù)自行摸索，以達(dá)到*分離效果，但zui大離心力不超過(guò) 1200g）。

3、離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。

4、用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。

5、250g，離心 10min。

6、棄上清。

7、用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

8、250g，離心 10min。

9、重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

【注意事項(xiàng)】

1、全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得*的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過(guò) 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

2、本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。

3、吸取過(guò)多的淋巴細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。

4、吸取過(guò)多的淋巴細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。

5、如所實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過(guò)低，請(qǐng)?zhí)旖驗(yàn)笠詫で髱椭?，具體詳見(jiàn)下方生產(chǎn)企業(yè)信息。

6、當(dāng)血液樣本粘度過(guò)高需稀釋時(shí)，*稀釋方法：將血液與樣本稀釋液（產(chǎn)品編號(hào)：2010C1119）1:1 稀釋混勻備用。注：不當(dāng)?shù)南♂尫椒〞?huì)降低細(xì)胞得率及活性。如血液樣本經(jīng)過(guò)稀釋則分離過(guò)程中需適當(dāng)降低離心力和離心時(shí)間。

7、因血液樣本的個(gè)體差異及血液粘度不同，需調(diào)整離心力及離心時(shí)間，離心力zui大不超過(guò)

1000g。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟

封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

【參考值（參考范圍）】

本實(shí)驗(yàn)淋巴細(xì)胞提取率及純度均大于 80%。

下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶(hù)可適當(dāng)進(jìn)行參考。

【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】

1、所獲得淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。

2、所獲得淋巴細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。

3、所獲得淋巴細(xì)胞的鑒定方法、A.流式細(xì)胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)C.原位雜交技術(shù)D.PCR 技術(shù)

【可能存在的問(wèn)題及解決方法】

1.  由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示：

• 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶(hù)可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。

• 本分離液依照標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類(lèi)產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。

注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到*分離效果，離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。