(1)細胞培養常見問題與解答

問：我看到培養板有4、6、12、24、48、96孔幾種規格 ，但不知道到底什么實驗用哪種規格。
答：要根據你具體的實驗要求，流式一般用6孔，MTT一般用96孔，細胞爬片一般用24孔等，要具體根據你實驗來定。

問：請問哪位高手知道Terasaki板是什么培養板，與普通細胞培養板有什么區別？
答：Terasaki plate主要是用于晶體學研究，產品設計便于對晶體的觀察與結構分析。有兩種sitting 和handingdrop兩種方法，兩種方法應用產品的外形結構也不同。材料上選擇crystal class polymer，特殊的材料有利觀察晶體結構。
細胞培養板主要是PS材料。材料是treated sufface。便于細胞貼壁生長與伸展。當然還有浮游細胞的生長材料，同時還有lowbinding surface，有關更多實驗材料上的應用與對材料的選擇。

問：我想測吸光度用酶標儀，用多孔細胞培養板行嗎？請問酶標板 多孔細胞培養板有什么區別？
答：用多空細胞培養板測吸光度肯定可以拉，我們經常用它來做樣品的蛋白定量和MTT檢測。
區別：酶標板一般要比細胞培養板貴，細胞板主要做細胞培養，但也可以用來測蛋白濃度；酶標板包括包被板和反應板，一般不能用做細胞培養，它主要做免疫酶聯反應后的蛋白檢測，它需要更高的要求還需要特定的酶標工作液。常用不同培養板的孔底面積及推薦加液量：不同孔板所加培養液的液面都不宜太深，一般在2-3mm范圍，結合不同孔的底面積就可算出各培養孔的適宜加液量。若加液量過多會影響氣體（氧氣）交換，而且在搬動過程中易溢出造成污染。具體所加細胞密度依實驗的目的不同靈活掌握。

(2)細胞培養板的密閉和污染問題
細胞培養板的加樣和操作：細胞培養板在進行細胞操作時同樣遵循嚴格無菌的原則，各項操作要保證規范、科學，不對細胞的生長造成額外的影響。這其中zui常見的問題就是如何保證加樣后細胞的均勻和盡量減少換液對細胞生長狀態的影響。

問：96，24孔培養板或培養皿的蓋子都很松，這樣是方便了透氣，但是細菌、霉菌等污染物會不會也隨著溜進去呢？
答：1.蓋子很松，屬于半開放培養，這樣的目的是透氣（實際上是為了使培養皿外的co2能夠與培養皿充分交換，維持培養基的pH值）。
2.凡事有利必有弊，這樣當然增加了污染的可能性。此外這樣還會使培養皿內的液體蒸發，這對于定量的藥物來說就顯得值得注意了。所以以下二條措施是必須的a培養箱內空氣必須清潔（定期紫外線照，酒精擦洗，盡量少開關培養箱）b培養箱內的濕度必須始終保持為100%（培養箱內放置無菌蒸餾水的水槽）。
就好像培養皿，也是一個蓋倒扣的容器，也不會污染。主要是因為蓋子“L"型邊緣產生氣流負壓的緣故，灰塵上面才附著有微生物，而氣流攜帶的灰塵是無法通過產生負壓的蓋邊緣的。而透氣作用只是通過空氣的擴散，不會產生氣流，所以只會透氣不會透菌。
我使用24孔板，在其中的某些孔中有操作(在超凈臺內)，而其它孔中還有細胞要培養.我很擔心這樣會污染，不知道要注意什么?大家不知道有什么好的建議。
在超凈臺內如果操作規范的話應該可以的，我想你可以充分利用培養版的蓋子，盡量只暴露要操作的孔，將其它孔用蓋子蓋起來。這是我的一點粗淺的見解，拋磚引玉吧！
使用前綜合考慮一下，充分使用所以的孔；如果只需要使用少數的孔可以只用一邊的，其余用蓋子蓋住，我習慣于先用右側的孔（右手加樣方便）。
其實自己感覺只要注意無菌操作，一般是不會污染的。操作時用幾塊玻片把板子一側墊高，不要把蓋子全打開，一般沒問題。

(3)細胞分布不均及解決辦法

問：我的細胞接種培養板，細胞總是聚集在周邊部分，該如何處理啊？我看園子里有的戰友的細胞卻是聚集在中間，是不是板子的質量問題啊？
答：請問你的細胞是如何混勻的？是滴管吹打還是振蕩培養板？如果是后者，而且是轉圈搖勻的話，很有可能由于離心力的作用使細胞甩到周邊部分，導致細胞中間少，四周多！自己可是試試！
周邊一般是相對會多一點，但是中間的數量也不會很少啊~~ 鋪板的時候我也沒有特異去振蕩培養板。
大概是板子的質量問題吧或者是不是鋪板時候的細胞密度太低了？我用的corning的板 。
一個好辦法：在你培養種板之前，把培養板放入培養箱里進行幾個小時的飽和后再取出，種入細胞時力量要輕，可采取用滴頭在培養板孔的側面慢慢加入讓細胞懸液流入板孔中，培養的細胞基本是均勻生長。記住千萬不要用振蕩器振蕩，否則你的細胞就會想你說得那樣聚積在一起。
我今天把培養板放入培養箱里幾個小時，適當的把細胞密度加大了一下，另外多加了一點培養液，今晚看細胞鋪的挺好的。我認為有兩種可能解決你問題的辦法:1.加入前吹打均勻;2.從多孔板側邊或底邊緩慢加入。

問：我在做原代培養時也遇到過這種情況，我一直以為培養皿鋪膠不均勻會導致這種現象，因為混勻的血管段加入到培養皿中時，在相差顯微鏡下血管段均勻分布在培養皿中，24h后貼壁的血管段就是周邊多，中間相對少些。下次我要試試hkqu戰友的方法看能否改變這種現象。

答：這種現象很正常呀，不知你仔細觀察過沒有，孔直徑愈小，這個現象越明顯，我試過，24、96孔板這種現象不可避免，因為液體的附壁使得孔內培養液不是成一個液平面，而是周邊高，就像凹鏡一樣，而使用這兩種孔板由于需要加干預等原因而不能加足量培養液，使得細胞隨培養液一起出現“邊集"現象，如果為了使孔中央也有均勻細胞而增加接種細胞數量的話，這要看你需要觀察何種指標，如果是MTT，免疫組化的話會因為細胞成層而影響結果。

(4)6孔板接種和換液問題：
問：我的細胞傳代很正常，但一種到六孔板里（不管加藥和對照），總有兩三個孔（隨機）細胞長得不好，很小，像破碎了。有人遇到過這種情況嗎？到底是啥原因呢？請各位指點
答：可能跟你加液的溫度有關。如果你細胞剛剛拿出來換液加液，培養基也是從4度冰箱拿出來不久，很容易細胞就會凍死了。建議你把培養基先在培養箱里邊孵育15min先。
另外，跟你細胞的生長狀態也有關。加藥之前的細胞可以用高點的血清濃度培養。保證細胞狀態良好。
或者放在37度水浴鍋里孵育也可以，或者是培養板本身的問題，你再換換其它培養板試試看。再有可能就是細胞狀態問題了，種板時的血清濃度調高試一下

問：zui近幾天，我用六孔培養板接種細胞，培養24小時后更換培養基，在更換培養基之前，顯微鏡觀察到細胞貼壁，狀態非常的好，更換了培養基后，立即用顯微鏡觀察，發現每個孔中都近乎有一半的細胞表現出近乎死亡的狀態。細胞變得非常小，產生大量的碎片，而另一半的細胞一切正常，異常細胞與正常細胞之間存在一條分水嶺，上半個圓是好的，下半個圓就不好，這是怎么一回事？

答：你可以看一下是不是培養板沒放水平。有一回我也出現過這種情況。
你的培養液如何，如果培養液過期，細胞就不會貼壁。換一點新配制的培養液試一試。
我也經常碰到，我想可能是板的問題，換一個牌子的板或換用培養瓶就沒問題了。
不知樓主所需換液的培養板多不多，換培養基的時候如果沒有注意風機的影響，特別是所需換液的培養板很多時，容易使細胞因風吹失水而干縮破裂。如果如此，換液時應該逐個培養板進行，別怕浪費吸管，注意操作的效率！

(5)24孔板接種問題：
問：把細胞消化接種到24孔板之后，已經四天了，老是每孔的中間部分長不滿，每天換液時都用PBS清洗，第二天換液時都出現同樣的情況，每孔的邊緣長的很好，中央大量死細胞？

答：我是選擇孔內鋪蓋玻片，在玻片上種植。每次換液都用PBS洗，必要的步驟嗎？另外，也有可能和細胞種類有關或者和培養液有關？
我想你的培養液可能加的太少了。由于表面張力的作用，培養板的邊緣液體會向上走，造成培養液面呈現一個凹面（就像量筒的液體凹面一樣），中央的細胞正好在凹面的zui低處，培養液少，細胞的營養不夠，甚至干涸掉，空氣中的氧氣也會造成損傷，即使有增值過來的細胞也會死掉。
另外，檢查一下培養箱底部的水是否少了，如果少了，箱內的空氣濕度不夠，會造成培養液揮發加快，這樣即使剛加的液體不少，過一段時間，由于蒸發，液體量會減少，造成中央干涸。并且這樣會改變了培養液的成分濃度，造成滲透壓過高。
個人經驗認為這是物理問題:24孔板小，細胞接種進去后是很難搖均勻的，結果導致細胞重貼壁后呈現四周密中間稀的狀況.至于中間較多死細胞，如果是懸浮狀的話，也一樣是物理問題。接種后比較粗暴的碰撞，似乎對搖均勻細胞有一定效果.

在為多孔板培養的細胞換液時一定要注意，不要把培養基吸得太干，如果*吸取，很容易造成細胞干涸，這樣的話細胞會很快死亡。我有一段時間總是遇到這個問題，一個板子中總有一兩個孔出現細胞大量死亡，后來發現是上面的原因。現在我做的時候如果必須把液體吸干，我會一個一個空來吸取，zui多一次不超過3孔，然后馬上加入液體，同時在作轉染時，我會在吸液和加液時將風機關掉，這樣基本上會避免細胞死亡。

同時你所說的細胞周圍密而中間稀疏，大約有如下原因：
1.培養液加得太少。主要是由于液體張力的問題。
2.細胞接種后震蕩太厲害了。由于離心力作用導致細胞分布到周圍。

細胞分布均勻與否有一點很關鍵，即每種細胞是有個體差異的，別人的細胞操作不一定適合于你.所以要靠自己摸索，且找出專屬于自己細胞的一套規律，有如下經驗：
1.所有待接種的細胞懸液在種板前一定要用吸管混勻。
2.按資料記載，24孔板的液體量為1ml，個人也覺得1ml的量足矣。
3.接種時，要慢慢加樣，且記得輕微旋轉槍頭，這樣做對細胞均勻分布有一定效果。
4.接種后直接放入培養箱讓細胞適應培養板這個新的環境，個人認為沒有必要在室溫放置一段時間。
5.根據細胞的特性，細胞均喜歡聚集在邊緣生長，所以我考慮到，你的問題還有可能是接種時的細胞密度不夠，導致周邊密集，中間稀疏的錯覺。你的拌種密度是多少？
另"要慢慢加樣，且記得輕微旋轉槍頭"的意思就是:加樣不能太快，避免細胞在一個加樣處聚集，且注意在不同的部位進行加樣，即邊加邊活動槍頭，人為使細胞趨于均勻分布，我個人覺得有一定的效果，不知這次我解釋清楚沒有。