藥敏試驗方法及不同菌類選擇藥敏紙片指南

藥敏試驗方法：
K-B法：
1 從孵育了16-24小時的瓊脂平板上（血平板），挑出單個菌落，直接用生理鹽水制成0.5麥氏單位。
2 在15分鐘內，用無菌棉拭子蘸取調好的菌液，在液面上方管壁處旋轉并用力擠壓幾次，以從中擠出過多的菌液。
3 用棉拭子在無菌的M-H培養基表面化線接種，再重復操作兩次，每次將平板轉動60度，每次接種都應保證接種物均勻分布，zui后用棉拭子涂抹平板的邊緣。
4 將確定好的藥敏紙片分貼到平板表面。每個紙片都應壓一下，以保證與平板表面*接觸。每個紙片中心間距24mm。紙片一旦與平板接觸，不應再移動。
5 貼完紙片后，應在15分鐘內放入35度孵箱。嗜血桿菌屬，鏈球菌屬放入3%-5%的CO2燭缸。
6 孵育24小時以后，測量各藥敏紙片抑菌圈直徑，與NCCLS手冊比較，作出結果判斷。 
說明：細菌藥敏結果的判斷以NCCLS為標準，所以藥敏試驗的每一步都應嚴格按照NCCLS操作，否則將失去意義。鏈球菌、奈瑟菌屬、流感嗜血桿菌、除銅綠假單孢菌和不動桿菌外的假單孢菌屬不用K-B法.            
肺炎鏈球菌膠乳凝集測定法
1 在一干凈玻片上分別滴兩滴生理鹽水。
2 從冰箱取出鑒定試劑(Slidex pneumo-kit)于室溫。
3 在其中一滴生理鹽水上滴加R1試劑，在另外一滴上滴加R2試劑，用攪拌棒混勻。
4 輕輕晃動玻片2分鐘，觀察結果。
5 2分鐘內，如R1出現凝集為陽性；如R1和R2均未出現凝集為陰性。
注：R3為陽性對照。
藥敏紙片的選擇
1、革蘭陰性桿菌（腸桿菌科）
頭孢噻肟（CTX）頭孢唑林（CZ）頭孢他定（CAZ）
氨芐西林（AM） 哌拉西林（PIP）阿米卡星（AN）
頭孢噻吩（CF）環丙沙星（CIP）頭孢呋辛（CXM）
慶大霉素（GM）頭孢噻肟/棒酸（CTX/CA）
頭孢他定/克拉維酸（CAZ/CA）羧芐青霉素（CB）
奧格門丁（AMX/CA）哌拉西林/三唑巴坦（PIP/TZ）
亞安培南 頭孢匹肟（FEP） 頭孢克羅（CEC）
2、銅綠假單孢菌/不動桿菌
妥布霉素（TM）阿米卡星（AN）安曲南（AZT）
頭孢哌酮（CFP）哌拉西林（PIP）頭孢匹肟
頭孢噻肟（CTX）環丙沙星（CIP）頭孢他定（CAZ）
左旋氧氟沙星（OFL）亞安培南 哌拉西林/三唑巴坦
3、金黃色葡萄球菌
苯唑西林（OX）青霉素G（P）頭孢唑林（CZ）阿米卡星（AN）
紅霉素（E）頭孢噻肟（CTX）環丙沙星（CIP）
萬古霉素 奧格門丁（AMX/CA）哌拉西林/三唑巴坦
頭孢噻吩（CF） 
4 、腸球菌
氨芐西林（AM）萬古霉素 環丙沙星（CIP）
慶大霉素（GM）紅霉素（E） 氧氟沙星（OFL）
5、除肺炎鏈球菌外鏈球菌
氨芐西林（AM）頭孢噻肟（CTX）萬古霉素
紅霉素（E） 氧氟沙星（OFL）克林霉素(CM)
肺炎克雷伯菌產酸克雷伯菌和大腸桿菌ESBLs的檢測
  MH培養基上貼頭孢他定，頭孢他定/克拉維酸，頭孢噻肟/棒酸，安曲南。
如頭孢他定的抑菌圈<22mm，安曲南<27mm，頭孢噻肟<27mm，意味可能有ESBLS產生。
如頭孢他定/克拉維酸與頭孢他定，頭孢噻肟/棒酸與頭孢噻肟的差值≥5mm，則確證ESBLS產生。
耐藥機制。
  一代頭孢對普通變形桿菌、枸櫞酸桿菌、腸球菌、假單孢菌屬、沙雷氏菌屬、擬桿菌屬無效。第二代頭孢對假單孢菌屬、不動桿菌屬、沙雷氏菌屬、腸球菌無效；腸球菌對頭孢類天然耐藥。氨基糖甙類抗生素阿米卡星與慶大霉素不*交叉耐藥。紅霉素類、四環素類等抗生素內部有相互交叉耐藥。
  金黃色葡萄球菌耐萬古霉素、無乳鏈球菌耐青霉素和氨芐青霉素、無乳鏈球菌和D群鏈球菌耐萬古霉素和替拉考寧為不可能的表型。
  洋蔥伯克霍德菌對氨基糖甙類、亞安培南天然耐藥。
  除表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌外，替拉考寧耐藥的凝固酶陰性的葡萄球菌不常見。
  金黃色葡萄球菌對復方新諾明耐藥為罕見表型。
氨芐青霉素對非發酵類不宜應用。
對于葡萄球菌，苯唑西林耐藥，青霉素敏感是不可能的。
NCCLS關于細菌藥敏實驗的說明
總評論：
1、頭孢噻吩可以代表頭孢噻吩、頭孢匹林、頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢克洛、和頭孢羥氨芐。但是，頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢泊肟、頭孢丙烯應單獨測試，因為某些對這些藥物敏感的菌株對頭孢噻吩是耐藥的。
2、利福平不能單獨用于化療。
腸桿菌科 
1對于沙門菌屬和志賀菌屬只有氨芐西林、喹諾酮、和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑可用于常規試驗與報告。初此之外，對于沙門菌屬和志賀菌屬的腸道外分離株，應測試并報告氯霉素和一種三代頭孢菌素。
2、克雷伯菌屬和大腸艾希菌的產ESBLS株對青霉素、頭孢菌素類或安曲南臨床治療可顯耐藥性，盡管在體外藥敏試驗對其中某些抗生素敏感。對于所有產ESBLs株，應報告為耐所有青霉素類、頭孢菌素及安曲南。
3、隨著3代頭孢菌素的治療，腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬和沙雷菌屬可發展其耐藥性。zui易敏感的菌株在開始治療3-4天就可變為耐藥，因此要反復測試這些菌株。
葡萄球菌
1、   青霉素敏感的葡萄球菌對FDA批準的用于葡萄球菌感染的其他青霉素類、頭孢菌素和碳青烯類也是敏感的。青霉素耐藥而苯唑西林敏感的菌株對β-內酰胺酶不穩定的青霉素是耐藥的，但對其他β-內酰胺酶穩定的青霉素、β-內酰胺酶抑制劑復合藥、相關的頭孢類和卡巴陪南是敏感的。苯唑西林耐藥的葡萄球菌對現在可用的所有β-內酰胺類抗生素是耐藥的。因此僅測試青霉素和苯唑西林就可以推知一大批β-內酰胺類抗生素的敏感性與耐藥性，不必常規測試其他青霉素類、β-內酰胺類抑制劑復合藥、頭孢類和卡巴陪南類。
2、   絕大多數的MRS對多種抗生素耐藥。包括β-內酰胺類、氨基糖甙類、大環內酯類、克林霉素和四環素。觀察到多重耐藥應該是對甲氧西林可能耐藥的線索。
3、   長期應用喹諾酮類治療的過程中葡萄球菌可發展其耐藥性，因此應重復測試耐藥性。
腸球菌
1、   對于腸球菌屬，頭孢菌素、氨基糖甙類（除了篩選高水平耐藥性）、克林霉素和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑在體外可能有活性，但臨床無效，因此不能報告細菌對這些藥物敏感。
2、   青霉素敏感性可以用于不產β-內酰胺酶的腸球菌對氨芐西林、阿莫西林、酰基氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林以及哌拉西林/三唑巴坦的敏感性
3、   氨芐西林是氨芐西林和阿莫西林類的代表藥。氨芐西林的結果可用來判斷不產β-內酰胺酶的腸球菌對阿莫西林/克拉維酸和氨芐西林/舒巴坦的敏感性。
4、   青霉素的結果可預測不產β-內酰胺酶的腸球菌對氨芐西林、阿莫西林、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/三唑巴坦的敏感性。
5、   對于血和腦脊液分離株需用頭孢硝噻吩β-內酰胺酶試驗，陽性提示對青霉素耐藥，同時對酰胺基、羧基和脲基青霉素耐藥。
細菌鑒別要點
1、   革蘭陽性球菌
所有革蘭陽性球菌*步為觸酶試驗。
通常觸酶陽性為葡萄球菌和微球菌，陰性為鏈球菌科。但不排除例外，氣球菌為弱陽性。糞腸球菌偶有陽性。操作觸酶試驗應盡量避免用鉑金取菌環（針）在H2O2 上涂菌，而應先涂菌，在滴H2O2，步驟不能顛倒。因為鉑金可以和H2O2產生假陽性反應。H2O2必須新鮮，若放置過久或暴露于光線下容易分解，必須保存于4℃冰箱。實驗所用菌須大量，不可挑到瓊脂，會產生假陽性。
對觸酶陽性的革蘭陽性球菌，應繼續做玻片法血漿凝固酶試驗，此為檢出葡萄球菌，如陽性一般為金黃色葡萄球菌；如陰性應做試管法凝固酶實驗確證，玻片法僅為篩選實驗。血漿凝固酶實驗用血漿須用兔或豬血漿，新鮮血漿不穩定，可能發生自我凝集或形成顆粒產生渾濁或產生沉淀而導致判度錯誤；不可使用人血漿，其含有抑制物質回干擾實驗結果。
觸酶陰性為鏈球菌科，根據菌落溶血進行下一步鑒定。а溶血：草綠色鏈球菌；肺炎鏈球菌；腸球菌
в溶血：A群鏈球菌；B群鏈球菌，部分D群鏈球菌
腸球菌也有不溶血菌落，不能根據溶血判斷腸球菌。鏈球菌主要實驗：膽汁七葉苷，七葉苷，菊糖，CAMP  ，桿菌肽，高鹽，奧樸托辛，膽鹽溶解。
腸球菌為致病菌，且腸球菌與非腸球菌耐藥機制不同，應進行鑒別，腸球菌分為糞腸球菌和屎腸球菌；非腸球菌分為牛鏈球菌和馬鏈球菌。腸球菌對青霉素耐藥，非腸球菌對青霉素敏感。腸球菌的藥敏注意高耐氨基糖甙的細菌，如高耐氨基糖甙則意味氨基糖甙與в內酰胺類藥物合用無協同作用。
肺炎鏈球菌與草綠色鏈球菌鑒別：肺炎鏈球菌奧樸托辛、菊糖、膽鹽溶解實驗皆為陽性。但這3個實驗都非特異，需聯合應用方為zui宜。肺炎鏈球菌的青霉素藥敏實驗應注意，當青霉素（K-B法）的抑菌圈直徑大于或等于19mm時為敏感，當小于19mm時不能確定是否中敏或耐藥，應做MIC稀釋確證。
2、革蘭陰性桿菌
包括腸桿菌科、非發酵菌和弧菌科。
*步實驗為氧化酶實驗。
氧化酶陰性為腸桿菌科；陽性為非發酵菌和弧菌科。
腸桿菌科包括大腸桿菌、變形桿菌、普羅菲登斯菌及摩根菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬、多源菌屬、沙雷菌屬、耶爾森菌屬。非發酵菌包括銅綠假單孢菌、黃單孢菌、不動桿菌等。
氧化酶實驗注意事項：①需用銅綠假單孢菌做陽性對照。
②60秒內判讀結果有效，而以10秒內zui宜。③不要用含微量鐵的取菌環或針，可用棉棒替代。
革蘭陰性桿菌的鑒定以API系列為國標，其他生化管僅為常規鑒定。