人外周血淋巴細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)

【包裝規(guī)格】200ml/瓶

【貨號(hào)】LTS1077

【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】

A． 適用儀器

zui大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)

B． 耗材

無(wú)菌膠頭滴管或塑料滴管

【檢驗(yàn)方法】

全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。

首先根據(jù)樣本量大小，分以下幾種情況：

一、 使用 15ml 離心管時(shí)：

情況 A：血液樣本量小于 3ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：

1.取一支 15ml 離心管，加入 3ml 分離液。

2.用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，400-650g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果）。

3.離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。

4.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。

5.250g，離心 10min。

6.棄上清。

7.用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

8.250g，離心 10min。

9.重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

情況 B：血液樣本量為 3-6ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：

1.取一支 15ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。

2.用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，450-650g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果，但zui大離心力不超過(guò) 1200g）。

3.離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。

4.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。

5.250g，離心 10min。

6.棄上清。

7.用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

8.250g，離心 10min。

9.重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

二、 使用 50ml 離心管時(shí)：

情況 A：血液樣本量為 6-10ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：

1.取一支 50ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。

2.用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500-950g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果，但zui大離心力不超過(guò) 1200g）。

3.離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。

4.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。

5.250g，離心 10min。

6棄上清。

7.用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

8.250g，離心 10min。

9.重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

情況 B：血液樣本量為 10-20ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：

1.取一支 50ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。

2.用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500-1100g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果，但zui大離心力不超過(guò) 1200g）。

3.離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。

4.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。

5.250g，離心 10min。

6.棄上清。

7.用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

8.250g，離心 10min。

9.重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

【注意事項(xiàng)】

全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得*的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過(guò) 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。

吸取過(guò)多的淋巴細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。

吸取過(guò)多的淋巴細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。

當(dāng)血液樣本粘度過(guò)高需稀釋時(shí)，*稀釋方法：將血液與樣本稀釋液（產(chǎn)品編號(hào)：2010C1119）1:1 稀釋混勻備用。注：不當(dāng)?shù)南♂尫椒〞?huì)降低細(xì)胞得率及活性。如血液樣

本經(jīng)過(guò)稀釋則分離過(guò)程中需適當(dāng)降低離心力和離心時(shí)間。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

18-25℃保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

【參考值（參考范圍）】

本實(shí)驗(yàn)淋巴細(xì)胞提取率及純度均大于 80%。

下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。

【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】

所獲得淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。

所獲得淋巴細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。

所獲得淋巴細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)C.原位雜交技術(shù)D.PCR 技術(shù)

【可能存在的問(wèn)題及解決方法】

1.  由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示：

本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。

本分離液依照標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。

注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到*分離效果，離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。